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  • 罗氏潮霉素B Roche Hygromycin B(潮霉素B)
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    罗氏潮霉素B作用机制:  

            潮霉素B是由吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)代谢产生的一种氨基糖苷类抗生素,通过抑制蛋白质合成而杀死细菌、真菌和高等真核细胞。潮霉素B通过干扰70S核糖体易位和诱导对mRNA模板的错读而抑制蛋白合成。目前常用于筛选和维持培养含潮霉素抗性基因的原核或真核细胞。 
     
    抗性基因: 
    对潮霉素B的抗性源自编码潮霉素B磷酸转移酶(Hph)的基因。至今发现两种来源: 
    Streptomyces hygroscopicus产生的Hph抗性基因;
    Escherichia coli,Klebsiella pneumoniae内质粒携带的Hph抗性基因(常用);  
     
    罗氏潮霉素B生物应用: 
    1) 筛选和维持培养稳定转染Hph 载体的原核细胞或真核细胞(植物细胞和哺乳动物细胞); 
    2)由于作用模式的差异,常与G418 (GeneticinTM),Zeocin™和blasticidin S联合使用,筛选稳定转染两个不同载体的细胞株;
    3)抗病毒剂,由于潮霉素B选择性渗透进入因为病毒感染增强通透性的细胞,而且具有抑制翻译的功效;
    4)作为驱虫药加入动物饲料; 
    双抗性稳定转染细胞筛选的抗生素作用机制及抗性
    抗生素抗性机制抗性基因哺乳动物筛选浓度
    潮霉素B干扰70S核糖体易位和诱导对mRNA模板的错读Hph200~500μg/mL
    G418干扰80S核糖体功能和抑制蛋白合成Tn5/Tn601100~1000μg/mL
    Zeocin掺入或者切割DNA引起细胞死亡Sh ble50~100μg/mL
    blasticidin S核糖体上抑制肽键形成Bsd/BSD3~50μg/mL

     
    罗氏潮霉素B应用浓度: 
    潮霉素B用来筛选稳转株的工作浓度需要根据细胞类型,培养基,生长条件和细胞代谢率而变化。推荐使用浓度为50-1000 μg/mL,zui佳浓度需要杀灭曲线来确定。 
    哺乳动物细胞·200-500 μg/mL;细菌/植物细胞·100-300 μg/mL;真菌·300-1000μg/mL; 
     
    罗氏潮霉素B产品使用:
    使用一:杀灭曲线确定zui佳杀死浓度(仅作参考,因个人检测体系而异)
    (1)往组织培养级的96孔板内加入未转染细胞,细胞密度约50-200细胞/孔;细胞贴壁之后,往每孔加入含不同浓度(如50-1000μg/mL,至少5个浓度)潮霉素B的200μL新鲜培养基;
    (2)37℃,5% CO2培养箱孵育细胞10-14天;
    (3)培养5-7天后更换新的培养液,培养液内含有相应浓度的潮霉素B;
    (4)10-14天后使用细胞增殖方法如MTT,CCK-8等评估细胞活力;也可以通过检测细胞克隆数或百分比汇合率来确定毒性效应。一般选择在10-14天能够杀死所有细胞的zui小浓度为zui佳筛选浓度。
    使用二:筛选稳定转染细胞
    (1)对于贴壁细胞,直接吸去60mm培养皿内的转染细胞培养基,然后加入含有潮霉素B的新鲜培养基5-6ml;对于悬浮细胞,无菌条件250x g,离心10min除去旧的转染细胞培养基,然后悬浮在约5ml的含潮霉素B的新鲜培养基;
    (2) 5-7天后,如上方法更换含有潮霉素B的新鲜培养基;
    (3) 再孵育细胞5-7天;
    (4) 10-14天孵育后,培养体系中只含有能够表达潮霉素B抗性表型的活细胞。因此筛选之后如步骤一,更换不含潮霉素B的新鲜培养基。 
     
    应用实例:
    物种细胞系/株质粒/载体筛选浓度
    E.ColiHB101/XL1-Blue/K802pEX-295~950 μM 
    RiceProtoplast pTRA132/pTRA14195~285 μM
    BarleyCallusbinary vector50 μg/mL
    Aspergillus nidulansG191/pDJB3-1pDH25250 ,>1000
    ChickenB cell line DT40N/A1500μg/mL
    HumanHEK293pUHD10-350 μg/mL
    MouseJ1 ESpBS524200 μg/mL
    HumanHMEC-1pCEP-4200 μg/mL
    DrosophilaS2pAc, pCoHygro500 μg/mL

    保存方法:溶液直接存放在2℃~8℃,至少存放1年。

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    培养基:Gibco培养基,Hyclone培养基 细胞培养基 微生物培养基

    主营:生化试剂、抗体、蛋白/多肽、分子生物学、细胞生物学、Elisa试剂盒、发光试剂盒、培养基、细胞、蛇毒试剂、标准品、 标准溶液……
    并代理abcam、Amresco、Axygen、ABI、Bioworld、Corning、CST、GE、invitrogen、Millipore、Roche、R&D、santa、sigma、thermofisher等品牌

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