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    供应:invitrogen Lipofectamine™ 2000 Transfection Reagent,lip2000,脂质体2000 货号: 11668-027(0.75ml) 11668-019(1.5ml) 保存条件:4℃ 保质期:3年

    Lipofectamine™ 2000转染试剂是一种阳离子脂质体,在体外可以转染许多种哺乳动物细胞,对各类细胞系都可提供zui高的转染效率,具有高效性和操作步骤简单的优点。脂质体2000其转染效率以及细胞活性取决于许多实验因素,如细胞密度、脂质体和DNA的浓度、脂质体2DNA复合物的作用时间以及是否有其它介质成分如抗生素和血清。

    使用Lipofectamine™ 2000试剂,您可以获得:
    *在多种细胞系中具有极高地转染效率和较高水平地重组蛋白表达
    *传输siRNA的优异性能
    *在有血清存在的情况下可保证转染效力——转染后无需更换培养基
    *保证可以用于高通量应用的试剂
    *用于建立稳定细胞系的可靠试剂Lipofectamine™ 2000试剂为大多数细胞提供了zui高的转染效率和活性。当存在血清或用于进行蛋白表达的细胞系(如COS-7,CHO和293)时,Lipofectamine™ 2000尤为有效,效率可超过90%。

    脂质体2000操作流程     
    事实上Lipofectamine系列产品操作流程都是又快又简单:稀释DNA以及Lipofectamine 2000,混合2种稀释液保温20分钟,加入培养细胞中孵育24-96小时检测结果。下面是Invitrogen提供的详细流程和注意事项。
    1、转染前一天,胰酶消化细胞并计数,细胞铺板,使其在转染日密度为90%。细胞铺板在0。5ml含血清,不含抗生素的正常生长的培养基中。
    2、对于每孔细胞,使用50μl无血清培养基(如OPTI-MEMⅠ培养基)稀释0。8μg-1。0μg DNA。
    3、对于每孔细胞,使用50μl OPTI-MEMⅠ培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE2000试剂。Lipofectamine 2000稀释后保温5分钟(在30分钟内同稀释的DNA混合。保温时间过长会降低活性。) 注意:即使Lipofectamine 2000使用OPTI-MEMⅠ稀释,细胞也可以使用D-MEM培养。如果D-MEM做为Lipofectamine 2000的稀释液,必须在5分钟内同稀释的DNA混合。
    4、混合稀释的DNA(第2步)和稀释的Lipofectamine 2000(第3步)。在室温保温20分钟。 注意:溶液可能会混浊,但不会影响转染。复合物可以在室温保持6小时稳定。
    5、直接将复合物加入到每孔中,摇动培养板,轻轻混匀。注意:如果在无血清条件下转染,使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。在加入复合物前移去生长培养基,替换为0。5ml无血清培养基。
    6、在37℃,5%的CO2中保温24-48小时,无须去掉复合物或更换培养基或者在4-5小时后更换生长培养基也不会降低转染活性。
    7、在细胞中加入复合物24-72小时后,分析细胞抽提物或进行原位细胞染色,检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达,在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中,两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。
    8、对于96孔板培养,不再需要提前一天进行细胞铺板,而可以直接在平板中制备复合物,然后将细胞悬浮液加入到复合物就可以了,这样进一步减少了转染时间。这种改进步骤已经过293-H,293-F,COS-7L和CHO细胞的试验,同传统方法相比活性稍低。快捷的步骤和蛋白表达细胞系的高效转染使得Lipofectamine 2000非常适用于96孔板的高通量转染,比如cDNA文库的筛选和蛋白瞬时表达。

    脂质体2000适用细胞株范围
    不同的转染试剂所适用的细胞株范围各不相同。一个实验室常常会用到不止一种细胞株,甚至是比较特殊的细胞株。一个转染试剂所适用的细胞株越多,当然越受用户的欢迎。根据Invotrogen的资料,Lipofectamine2000已经证实可用于高达517种细胞株,覆盖了相当广的范围。要看看Lipofectamine 2000是否适用于你现有的细胞株,可以访问以下Invitrogen(http://www。invitrogen。com/content。cfm?pageID=9559&fuseaction=CellLines。dsp_searchRange)

    适用的核酸类型和DNA大小
    有的转染试剂是为siRNA转染而设计的,有的则是为DNA转染设计。Lipofectamine 2000可以适用于包括DNA,siRNA,dsRNA, 荧光标记的Oligo, RNA等在内的核酸转染,这使得Lipofectamine2000适用范围非常广泛,无论是基因表达分析的DNA转染,或者是RNAi,Lipofectamine 2000都能胜任,不需要为不同目的购买不同试剂了。但,zui常用的DNA转染中有一个DNA大小的问题,太大的质粒不那么好转。

    脂质体2000用量
    Lipofectamine 2000用的剂量根据说明书,24孔板转染每次用2ul左右,1.5ml Lipofectamine 2000大约可做750次24孔板转染,或者大约150次6孔板转染。

    注意事项     
    Lipofectamine2000要求细胞铺板密度较高,以90%-95%为佳,这有助于减少阳离子脂质体细胞毒性造成的影响。Lipofectamine 2000可用于有血清培养基的转染,并且转染前后不需要换培养基,使得操作方便了许多,但是要注意制备转染复合物时要求用无血清培养基稀释DNA和转染试剂,因为血清会影响复合物的形成。
     
    复合物形成后是可以加入血清。这里要特别注意检测所用的无血清培养基是否能和Lipofectamine 2000匹配,比如已知CD293, SFMII,VP-SFM就不行。此外还应该留意,如果研究的基因要求比较长的表达时间,比如细胞周期相关基因,或者时细胞表面蛋白,zui好选择细胞铺板密较低的转染试剂,不适合用Lipofectamine 2000。

    对于大多数阳离子脂质体试剂,应优化DNA浓度和阳离子脂质体试剂量以得到zui大的转染效率。DNA和转染试剂的比例,通常推荐是1:2或者1:3,优化可以从0.5-5之间慢慢试。使用小剂量确定的优化条件可以用于进行大剂量的转染,只要根据培养板表面比例线性增加铺板细胞的数目、阳离子脂质体试剂和DNA量就可以了。
     
    还有转染的时候培养基中不能添加抗生素。抗生素,比如青霉素和链霉素,一般对于真核细胞无毒,但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性,使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性,导致转染效率低。所以,在转染培养基中不能使用抗生素,甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。这样,在转染前就不必润洗细胞。对于稳定转染,不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素,因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。另外,为了保证无血清培养基中细胞的健康生长,使用比含血清培养基更少的抗生素量。
     
    阳离子脂质体应该在4度保存,要注意避免多次反复长时间开盖,因为可能会导致脂质体氧化而影响转染效率。当然还有要注意质粒的质量,质粒的内毒素是转染的大敌。
     

    本公司还提供以下产品:

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    Hyclone 30087.02(南美普通胎牛血清)500ml
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    Gibco 16141-079 胚胎干细胞专用胎牛血清 500ml
    PAA A15-101 德国PAA 普通胎牛血清 500ml
    PAA A15-151 德国PAA 优级胎牛血清 500ml
    美国GIBCO 26400-044 (GIBCO透析型胎牛血清) 500ml
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    美国GIBCO 16140-071 (GIBCO灭活过胎牛血清) 500ml
    美国GIBCO 10439-024 (GIBCO胚胎干细胞专用胎牛血清) 500ml
    SH30070.03E (Hyclone干细胞胎牛血清) 500ml
    SH30068.03(Hyclone活性炭处理胎牛血清) 500ml

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